论著 | 结核分枝杆菌真核细胞MmpS5-MmpL5的表达及功能研究

和MmpS5-MmpL5亚基在耻唯分枝杆霉之中的解读法制，并对其新功能顺利进行了研究工作，以期为全面性亚基浓缩并研究工作Bdq的海上海上运输前提打好基本。

材料和新方法

一、科学实验霉株

MTB规格株H37Rv（ATCC 27294）和耻唯分枝杆霉Mycobacterium smegmatis MC2 155（ATCC 700084）由首都医科大学自建杭州胸科医院/朝阳区效药性缺血性病信息化麻省理工学院保存并提供。

二、科学实验用药

Bdq（上海瀚香海洋生物新材料一些公司；批号：20200518；纯度≥98%）、异烟肼（美国Sigma一些公司；批号：MKBV9475V；纯度≥99%）。

三、 器材与醛

1.器材：Nuaire701氧气保温人才培养箱（美国Nuaire一些公司）、Infinite 200多新功能蛋白酶标祯（奥地利Tecan一些公司）、GENEPRO多新功能等位基因增为祯（苏州博日新材料股份有限责任一些公司）、Amersham Imager 600亚基光学祯（美国GE一些公司）、Max-Q8000较高温摇床（美国赛默飞世尔新材料一些公司）、DS-11FX超微量红外和光度计（美国DeNovix一些公司）、Tanon-4200全自动数码化悬浮光学子系统（上海天能新材料有限责任一些公司）。

2.醛：pMV261核糖体为本麻省理工学院保存；KpnⅠ（R0142V）、BamHⅠ（R0136V）、EcoRⅠ（R0101V）、HpaⅠ（R0105V）、HindⅢ（R0104V）除此以外售给美国纽英伦海洋生物高效率一些公司；E.coli DH5α售给宝材料科学（长春）有限责任一些公司（批号：R2015V）；pLB零背景快速联接醛盒售给天根生化新材料（杭州）有限责任一些公司（批号：VT205）；ATP检飞行测醛盒（S0026）、雅超敏ECL矿物学发和光醛盒（P0018AS）、苯甲基磺酰氟（PMSF；ST506）、膜真核膜与膜浆亚基提合醛盒（P0033）除此以外售给上海碧云天海洋生物高效率有限责任一些公司。

四、彼此之间结合区别于苯甲酸首页的乙酰胺可借型详见征pMV261s

引入PCR的新方法从耻唯分枝杆霉之中增为乙酰胺蛋白酶等位基因，多肽数列如下：AI-F：5'-ctaggtaccagtgacgcggtctcaagcg-3'（KpnⅠ），AI-R：5'-ctaggatcc-aaaactacctcgggcatgtgg-3'（BamHⅠ），引号所在位置为蛋白酶切位点。PCR中两者之间体后目标等位基因与pLB复制详见征联接，目标完整版经琼脂糖悬浮电泳回收与pMV261详见征双蛋白酶切后联接。外观设计一段在N末端另有有6×His苯甲酸首页的数列，并加进BamHⅠ及HpaⅠ的蛋白酶切位点黏性侧边，数列如下：261-F：5'-gatcctcaccaccaccaccaccacactagtcagctgcagaattcatatgcatcgatggtt-3'（斜体加注序归入6×His苯甲酸首页数列）；261-R：5'-aaccatcgatgcatatgaattctgcagctgactagtgtggtgg-tggtggtggtgag-3'，将上述核糖体经BamHⅠ及HpaⅠ双蛋白酶切后，与此数列联接,彼此之间结合区别于苯甲酸首页的乙酰胺可借型详见征，命名为pMV261s。

五、目标等位基因与pMV261s的联接及再生

根据NCBI之中MTB规格株H37Rv的mmpS5及mmpL5的等位基因数列外观设计多肽，多肽数列如下：mmpS5-F：5'-ccggaattcgatgattggaactctcaagc-3'和mmpL5-F：5'-ccggaattcgatgatcgtgcaaaggac-3'（EcoRⅠ） ；mmpL5-R：5'-ccggttaactcagaccaaggcgaagg-3'（HpaⅠ）；彼此之间结合mmpS5-mmpL5全长等位基因，前多肽为mmpS5-F，后多肽单独为mmpL5-R。PCR增为，琼脂糖悬浮电泳，切胶回收，pLB详见征过夜联接提合目标等位基因。EcoRⅠ及HpaⅠ双蛋白酶切的目标等位基因与pMV261s详见征联接，再生联接衍生物至E.coli DH5α大肠杆霉感受态膜，挑合阳性复制并PCR的测试。

将PCR的测试适当的另有mmpL5及mmpS5-mmpL5等位基因的核糖体及自在核糖体电转去耻唯分枝杆霉感受态膜，电转条件为电压2500 V、电容25 μF，电阻1000 Ω，电再生足球赛厚度2 mm。再生后于另有10% OADC添加剂的7H9人才菌落之中37 ℃保温摇床此后人才培养4 h，吸合一定个数涂布在另有终电导叛将为50 μg/ml的卡那霉素的LB平筒上，挑合单复制于7H9＋10% OADC＋50 μg/ml卡那霉素人才菌落人才培养。

六、MmpL5及MmpS5-MmpL5亚基的解读

待霉凝胶人才培养至波段600 nm所在位置吸和光度最大值（A600最大值）等于0.8，转至终电导叛将为0.2%的乙酰胺溶凝胶可借亚基解读，37 ℃条件下此后人才培养20 h，搜集可借解读后的霉凝胶，离心后弃上和光绪年两者之间，霉盐类用预冷的磷酸盐糖类（PBS）重悬，离心弃上和光绪年两者之间，霉盐类转至膜真核膜与膜浆亚基抽提醛A和PMSF，悬浮后冰浴10～15 min，冷却经年累月祯经年累月亚硝酸盐，4 ℃ 1200×g离心10 min，搜集上和光绪年两者之间凝胶，此后14 000×g离心30 min，吸除上和光绪年两者之间，盐类转至真核膜抽提醛B，耦合后冰浴14 000×g离心 5 min，抽提真核膜。

七、亚基免疫中两者之间体区别于分析新方法

提合的亚基顺利进行十二烷基碳酸钠里外衍生物悬浮电泳（SDS-PAGE），转移至里外偏氟乙烯（PVDF）膜，用另有5%脱脂奶粉的TBST糖类封闭2 h，转至1∶2000的效苯甲酸鼠源IgG单复制效体一效，TBST糖类洗脸一效，转至1∶5000的羊效鼠IgG二效雏鸟，TBST糖类洗脸二效，转至辣根丙酮蛋白酶显色剂雏鸟后，顺利进行矿物学显色扫描。

八、潮湿弧线的定量

为了的测试特罗斯季亚涅齐等位基因解读对耻唯分枝杆霉潮湿的因素，定量了自在核糖体、解读MmpL5及MmpS5-MmpL5的霉株的潮湿弧线。将这3种细霉人才培养至倍数潮湿期后，调整A600最大值恰当，便按1%接种在另有0.05%玛莎-80的7H9+10%OADC人才菌落之中，37 ℃保温摇床此后人才培养，不两者之间断5 h定量1次A600最大值，每个样品设为2个海洋病理学反复，素描潮湿弧线。

九、扫描效霉用药对耻唯分枝杆霉的最小抑霉电导叛将（minimal inhibitory concentration，MIC）

将3种细霉人才培养至倍数潮湿期，用7H9＋10%OADC人才菌落将霉凝胶混合物至终电导叛将为1×105 CFU/ml。合96盖金色人才培养筒，依次将异烟肼及Bdq倍比混合物。37 ℃人才培养3 d后，各盖转至20 μl的阿尔玛蓝和12.5 μl的20%玛莎-80，37 ℃此后人才培养24 h，据信各盖蓝色，紫色详见示霉株无潮湿，红色详见示有霉潮湿，MIC详见示由紫色变成红色的的最较高用药电导叛将。

十、耻唯分枝杆霉对溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）的吸合科学实验

MmpS5-MmpL5亚基统称RND还原酶外排燃气，EtBr常被可作飞行测试用药外排燃气活性的规格外观设计中两者之间体物。离心搜集人才培养至倍数潮湿期的3种细霉，先用PBS重悬洗涤亚硝酸盐2次，调节各霉A600最大值为0.4，吸合198 μl重悬霉凝胶，转至2 μl电导叛将为100 μg/ml的EtBr至终电导叛将为1 μg/ml，混匀，立即用Infinite M200多新功能蛋白酶标祯扫描荧和光最大值，设为激发波段为545 nm，火箭波段为590 nm，不两者之间断5 min扫描1次，共扫描60 min，设为3个海洋病理学反复。

十一、耻唯分枝杆霉ATP甜度定量

合人才培养至倍数潮湿期的3种细霉，用7H9人才菌落调节A600最大值为0.4，向霉凝胶之中转至终电导叛将为1/2 MIC（0.125 μg/ml）的Bdq，雏鸟24 h，离心搜集等个数的3种细霉，离心后弃上和光绪年两者之间，霉盐类转至裂解凝胶，耦合混匀。96盖金色人才培养筒之中转至100 μl裂解霉凝胶和100 μl混合物后的ATP扫描凝胶，蛋白酶标祯定量彼此之间对和光该单位（relative light unit，RLU）最大值，根据规格弧线及定量的RLU最大值计算造出各霉凝胶之中的ATP甜度。

十二、数学新方法所在位置理

使用SPSS 26.0软件顺利进行数据所在位置理及分析新方法，计量资料完全符合对数，引入“x¯±s”描述，三第三组两者之间差异性的彼此之间对引入单主因方差分析新方法，实质性的第三组内两两彼此之间对引入student t验证，以P＜0.05为差异性有数学新方法意涵。

结 果

一、区别于苯甲酸首页的乙酰胺可借型详见征pMV261s的彼此之间结合

通过高效率改造pMV261穿梭详见征，添加乙酰胺蛋白酶位点等位基因（pACE），并添加苯甲酸首页便于改第三组亚基的的测试及浓缩，彼此之间结合区别于苯甲酸首页的乙酰胺可可借型解读详见征pMV261s。对耻唯分枝杆霉乙酰胺蛋白酶位点等位基因顺利进行PCR增为，完整版总长度为2618 bp（上图1），联接pLB复制详见征成pLB-pACE，KpnⅠ及BamHⅠ双蛋白酶切后目标下末端个数适当（上图2），在乙酰胺蛋白酶位点等位基因上有HindⅢ蛋白酶切位点，在另有苯甲酸首页的数列上有EcoRⅠ蛋白酶切位点，双蛋白酶切后完整版总长度为1584 bp（上图3）。由此证明崇祯苯甲酸首页联接最终，同时PCR的测试适当，pMV261s详见征彼此之间结制备功。

二、pMV261s-mmpL5和pMV261s-mmpS5-mmpL5解读详见征的彼此之间结合

PCR新方法增为MTB的mmpL5及mmpS5-mmpL5等位基因，mmpL5完整版总长度为2895 bp，mmpS5-mmpL5完整版总长度为3320 bp，目标等位基因下末端个数适当（上图4），EcoRⅠ和HpaⅠ双蛋白酶切目标等位基因及pMV261s解读详见征，双蛋白酶切下末端个数适当（上图5，6），PCR结果无甲基化。

三、MmpS5-MmpL5及MmpL5亚基在耻唯分枝杆霉之中的解读

对经乙酰胺可借的pMV261s-mmpL5、pMV261s-mmpS5-mmpL5改第三组霉株及pMV261s自在核糖体霉株顺利进行亚基免疫中两者之间体区别于分析新方法，MmpL5亚基彼此之间对水分子准确性为104 800，MmpS5-MmpL5亚基彼此之间对水分子准确性为120 100，补足6×His苯甲酸首页合第三组的改第三组亚基，在彼此之间对水分子准确性为110 000～130 000所在位置造出现目标下末端，而自在核糖体霉株没下末端（上图7），详见明崇祯MmpL5及MmpS5-MmpL5亚基在耻唯分枝杆霉之中最终解读。

四、MmpL5和MmpS5-MmpL5亚基的解读对耻唯分枝杆霉潮湿无因素

为考察MmpL5和MmpS5-MmpL5亚基的解读是否因素耻唯分枝杆霉的潮湿雅性，彼此之间对3种细霉的潮湿弧线，见到解读mmpL5及mmpS5-mmpL5等位基因的耻唯分枝杆霉与随身携带pMV261s自在核糖体的耻唯分枝杆霉，除此以外在15 h便踏入倍数潮湿期，25 h翻倍平台期，三者潮湿雅性没最大值得注意差异性（上图8）。

五、Bdq对解读MmpS5-MmpL5亚基的耻唯分枝杆霉的敏感度降较高

异烟肼对解读MmpL5及MmpS5-MmpL5亚基的改第三组耻唯分枝杆霉及随身携带自在核糖体的耻唯分枝杆霉的MIC除此以外为1 μg/ml，详见明崇祯异烟肼不是MmpS5-MmpL5亚基外排子系统的中两者之间体物。Bdq对解读MmpL5亚基及区别于自在核糖体的耻唯分枝杆霉的MIC最大值为0.25 μg/ml，而对解读MmpS5-MmpL5亚基的耻唯分枝杆霉的MIC为2 μg/ml，MIC最大值增加了8倍。由此证明崇祯，MmpL5与MmpS5亚基共解读才能把握无论如何，且MmpS5-MmpL5亚基的解读避免Bdq的效药性。

六、解读MmpS5-MmpL5亚基的耻唯分枝杆霉外排灵活性进一步增加劲

扫描改第三组耻唯分枝杆霉对EtBr的吸合，见到解读MmpL5亚基与随身携区别于pMV261s自在核糖体的耻唯分枝杆霉对EtBr的吸合大致彼此之间同（△荧和光强劲度最大值分别为655和642），而解读MmpS5-MmpL5亚基的耻唯分枝杆霉对EtBr的吸合）（△荧和光强劲度最大值为395）较MmpL5第三组和pMV261s自在核糖体第三组增加分之一40%（详见1），明确指出崇祯MmpS5-MmpL5亚基具有外排灵活性，而没MmpS5的MmpL5亚基无法产生外排燃气。

七、Bdq对解读MmpS5-MmpL5亚基的耻唯分枝杆亚硝酸盐内ATP甜度因素较小

使用1/2 MIC电导叛将的Bdq无论如何24 h后，彼此之间对用药无论如何前后亚硝酸盐内ATP甜度的巨大变化。Bdq无论如何前解读MmpL5亚基第三组亚硝酸盐ATP上佳[（0.193±0.028）μmol/L)]、解读MmpS5-MmpL5亚基第三组亚硝酸盐ATP上佳[（0.197±0.018）μmol/L]与随身携带pMV261s核糖体第三组亚硝酸盐ATP上佳[（0.181±0.013）μmol/L]彼此之间比，差异性无数学新方法意涵（F=0.539，P=0.609）。Bdq无论如何后，解读MmpL5亚基第三组亚硝酸盐ATP上佳[（0.056±0.009）μmol/L]与pMV261s自在核糖体第三组亚硝酸盐内ATP上佳[（0.055±0.008）μmol/L]彼此之间比，差异性无数学新方法意涵（F=62.914，P=0.929）。用药无论如何后，解读MmpS5-MmpL5亚基的改第三组耻唯分枝杆霉内ATP上佳[（0.125±0.010）μmol/L]降较高36.49%，而解读MmpL5亚基第三组亚硝酸盐ATP上佳降较高71.21%，自在核糖体第三组亚硝酸盐ATP上佳降较高69.49%，解读MmpS5-MmpL5亚基第三组亚硝酸盐ATP上佳最大值得注意高于解读MmpL5亚基第三组和自在核糖体第三组，差异性有数学新方法意涵（F=5.172，P=0.049）。这指引MmpS5与MmpL5亚基作为复合体避免亚硝酸盐外排Bdq灵活性减低，使Bdq无论如何于ATP嘌呤的经年累月，从而使亚硝酸盐内ATP上佳下降较少。

讨 论

外排燃气并不需要将亚硝酸盐内用药燃气造出，外排燃气过解读使得亚硝酸盐内用药电导叛将无法有效率选择性分枝杆霉潮湿，是MTB效药性的极为重要情况之一。MmpL是分枝杆霉等位基因第三组格式的两第三组真核膜，统称外排燃气RND亚基还原酶，在脂质、里外合物和免疫中两者之间体调节剂的海上运输过程之中把握极为重要无论如何。来龙去脉开发团队前期研究工作见到，Bdq和萘法齐明崇祯对Rv0678甲基化的MTB横向效药性，Rv0678甲基化避免mmpL5和mmpS5解读的上调。近些年研究工作详见明崇祯，MmpS5-MmpL5子系统也可以海上海上运输分枝霉素。MTB格式13种MmpL亚基，其之中，MmpL5亚基（Rv0676c等位基因格式）由964个氨基酸合第三组，理论彼此之间对水分子准确性为104 800，由12个跨膜糖蛋白及2个周质糖蛋白合第三组。自建亚基MmpS5（Rv0677c等位基因格式）由142个氨基酸合第三组，理论彼此之间对水分子准确性为15 200。mmpL5在基因表达上与mmpS5等位基因彼此之间衍海洋生物，二者坐落于同一操纵子内，受三角洲的基因表达选择性变异Rv0678的依赖性。Andries等在MTB之中实际上过解读MmpS5亚基没变动Bdq对其的MIC最大值，指引一般而言的MmpS5亚基对用药外排无因素，因此，本研究工作之中没实际上彼此之间结合MmpS5亚基。

真核膜的解读与浓缩一直是亚基研究工作的高效率难题，来龙去脉课题第三组前期在BL21plys大肠杆霉及C43大肠杆霉之中多次尝试解读真核膜MmpL5亚基都未能获得理想结果，显然是特罗斯季亚涅齐真核膜在大肠杆霉之中的毒性、出错折叠、群里外等避免解读量较高。MTB的MmpL5与耻唯分枝杆霉同源MSMEG_1382的数列同源为62.96%，详见明崇祯MmpL5亚基解读除此以外的条件在耻唯分枝杆霉显然兼顾。耻唯分枝杆霉无传染性和致病性，潮湿较快、操作较为容易。这些雅点都是耻唯分枝杆霉作为解读宿主霉的占优。乙酰胺蛋白酶位点是一种强劲位点，在耻唯分枝杆霉之中受到严谨依赖性，可借后高上佳解读。Zhang等来顺利进行乙酰胺蛋白酶位点彼此之间结合了MmpL3解读详见征，最终充分利用了在耻唯分枝杆霉之中解读和浓缩。本研究工作通过高效率改造pMV261穿梭详见征，彼此之间结合了区别于苯甲酸首页的乙酰胺可借型解读详见征pMV261s-mmpL5和pMV261s-mmpS5-mmpL5，亚基免疫中两者之间体区别于的测试了亚基在耻唯分枝杆霉的最终解读。

本研究工作通过Bdq对3种改第三组霉株的用药敏感度次测试见到，共解读MmpS5-MmpL5亚基的耻唯分枝杆霉都会降较高Bdq对其的活性，而仅解读MmpL5亚基的改第三组耻唯分枝杆霉对Bdq的用药敏感度无因素。这与Yamamoto等见到MmpS5促成MmpL5亚基单里外体第三组装成四里外体把握新功能的结果恰当。EtBr是一种荧和光原料，是彼此之间当多外排燃气的海上海上运输中两者之间体物，通常被可作飞行测试用药外排燃气活性的规格外观设计中两者之间体物。改第三组耻唯分枝杆霉对EtBr的吸合科学实验详见明崇祯，MmpS5-MmpL5亚基解读比MmpL5亚基实际上解读和自在核糖体第三组对EtBr的吸合量较少，其外排灵活性减低。实际上MmpL5亚基解读与自在核糖体彼此之间比没差异性，实质性明确指出崇祯MmpS5和MmpL5亚基共解读产生外排燃气，把握海洋病理学新功能。人口为120人甲苯的无论如何效病毒是ATP嘌呤，进而避免亚硝酸盐内的ATP制备增加而把握效霉无论如何。为了考察Bdq通过MmpS5-MmpL5亚基外排因素亚硝酸盐内ATP上佳，来龙去脉在1/2 MIC电导叛将的Bdq无论如何下，见到共解读MmpS5-MmpL5亚基的耻唯分枝杆霉亚硝酸盐内ATP甜度较解读MmpL5亚基和随身携带自在核糖体第三组巨大变化小。紧密结合MmpS5-MmpL5亚基共解读避免的外排灵活性进一步增加劲，详见明崇祯MmpS5-MmpL5亚基外排子系统以Bdq为中两者之间体物，通过减低Bdq的外排量使亚硝酸盐内Bdq的甜度降较高，进而使Bdq选择性效病毒ATP嘌呤的经年累月，避免亚硝酸盐内ATP上佳的巨大变化较少。

综上所述，来龙去脉彼此之间结合了MTB的真核膜MmpL5及外排燃气MmpS5-MmpL5在耻唯分枝杆霉之中的解读法制。新功能科学实验也详见明崇祯了MmpS5-MmpL5亚基共解读产生外排燃气把握无论如何，降较高Bdq的用药敏感度。本研究工作战略规划了对Bdq效药性前提的思考，而真核膜解读法制的彼此之间结合为亚基的浓缩和实质性研究工作Bdq的海上海上运输前提打好了基本。

（参考资料略）

注：除非雅别道歉信，本政府会号登出的所有社员论不代详见《之中国防痨时尚杂志》刊物社员观点。

编辑：孟 莉

审校：潘春和

披露定于：2022-04-01

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